隨著流式細胞儀的普及，流式細胞術的應用越來越廣泛，特別是免疫學和干細胞生物學研究領域，流式細胞術必不可少，然而，大家對流式細胞術的掌握程度參差不齊，大部分科研工作者對流式的應用還局限于四色以內分析，對于多色（6色以上）分析往往掌握不好，究其原因是染料搭配不合適，導致各染料之間干擾很大，結果很難分析。本文總結了流式多色染色熒光搭配的六點技巧，希望對廣大科研工作者有一定的參考作用。
一：選擇流式細胞儀能檢測的染料
當流式細胞染色確定好指標之后，需要給每個指標對應的抗體配上相應的熒光染料，我們需要選擇流式細胞儀能檢測的染料，這就要求我們了解流式細胞儀以下信息：1、儀器有幾個激發器（激光管）；2、每個激發器對應有哪些檢測通道。
下表列出了流式細胞儀的激發器和每個激發器對應能檢測的染料：
上表僅列出了每個激發器可能激發的染料，并未列出所有染料，但不是儀器配置了該激發器就一定能激發出對應的染料，還需要根據儀器的通道配置來選擇，即每個激發器對應有哪些檢測通道，而每個檢測通道只能對應檢測一種染料，但不同染料可能是由同一個檢測通道來檢測，那么這些染料我們稱之為熒光對等染料，熒光對等染料是不能共用的。
下表列出了每個通道的熒光對等染料：
二：弱表達抗原選擇強熒光染料，強表達抗原選擇弱熒光染料
熒光染料亮度有強弱之分，抗原表達有高低區別，因此，對于一些低表達的抗原，我們在搭配對應抗體的染料時，應該選擇熒光較亮的染料，而對于高表達的抗原，我們則可選擇相對較暗的熒光染料。
因抗原表達密度受細胞類型以及細胞活化程度的影響，所以在此無法詳細列出各抗原的表達密度強弱。但熒光染料的強弱是固定的，下表列出了常見熒光染料的強度對比圖。
三：低表達抗原應該選擇染料之間有較小干擾的染料（即將弱表達抗原放在被干擾較小的檢測通道），強表達抗原應該選擇染料之間對其他染料干擾較小的染料（即將強表達抗原放在對其他通道干擾較小的檢測通道）
低表達的抗原最終染色的信號較弱，容易受其他檢測通道的干擾，因此為了減少其他通道的信號對其造成的干擾，我們應當選擇干擾較小的檢測通道，比如FITC\ PE\ PE-Cy7\ APC這四色一起檢測時，弱表達抗原應該搭配APC熒光染料標記的抗體；強表達的抗原最終染色的信號較強，容易對其他檢測通道造成干擾，因此我們應該選擇對其他通道干擾較小的熒光染料，舉例如上。
四：表達互相排斥的抗原可以放在相互干擾較大的檢測通道，共表達的抗原避免放在相互干擾的通道
表達相互排斥的抗原指的是兩種抗原不會同時表達在一種細胞上，這兩種抗原表達在兩種細胞上（例如CD4和CD8），因此流式圖上分群很明顯，即使熒光染料之間干擾很大，也很容易通過補償的調節避免干擾；而共表達的抗原指的是這兩種抗原表達在同一種細胞上（例如CD4和CD25），在流式圖上我們是要分析雙陽性的細胞比例，因此如果這兩個抗體對應的熒光染料之間有干擾，則會對圈門結果造成干擾，影響分析的細胞比例。
五：細胞內抗原檢測優先選擇小分子熒光素
胞內抗原的檢測需要打孔，讓標記熒光素的抗體分子可以進入細胞內，因此有兩點要求，第一打孔試劑對熒光素沒有影響，這就要求我們盡量不要選擇復合染料（固定劑會使復合染料解偶聯），第二確保熒光素標記的抗體可以進入細胞內，這就要求熒光素標記的抗體分子量盡量小，所以我們優先選擇小分子應該素，例如PE\ FITC\ APC。
六：上級抗原檢測通道避免對下級抗原檢測通道造成干擾
下級抗原是在上級抗原的基礎上分析的，例如我們圈門CD45(上級抗原)分析CD3(下級抗原)陽性的細胞，這要求我們上下級抗原之間盡可能減少熒光之間的干擾，否則會影響圈門分析的結果。
以上所述六點技巧是多色配色中需要注意的要點，當然涉及多色配色（6色以上）往往很難同時達到上述六點技巧，我們只能盡可能滿足這些要求，減少因熒光染料搭配不當對實驗結果的影響。
篇幅所限,未盡之處請繼續關注我未來的帖子!