概述
淋巴瘤是臨床上診斷難度較大的一類疾病，需要綜合血液病理學(包括組織和細胞形態學、免疫表型、遺傳學和分子生物學)與臨床特征才能做出精確診斷。流式細胞學(flow cytometry，FCM)免疫分型作為與免疫組織化學相補的診斷方法，以其快速、客觀、定量及多參數分析等獨特優勢，在淋巴瘤診斷方面發揮著不可替代的作用。為了提高淋巴瘤的診斷和治療監測水平，規范我國對此類疾病的診治程序，中國抗癌協會血液腫瘤專業委員會組織國內相關的流式、血液腫瘤和病理專家經過多次討論，結合國外已有文獻資料和國內臨床經驗，制訂了流式檢測技術在淋巴瘤診斷中應用的專家共識。本共識旨在推動流式檢測技術在淋巴瘤診療中的應用，促進多學科合作在淋巴瘤診療中的發展。
由于目前FCM對霍奇金淋巴瘤診斷價值有限，本文內容僅涉及FCM在非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphomas，NHL)中的應用。
FCM在淋巴瘤診斷中的地位與作用
FCM在淋巴瘤診斷中的作用主要分為三個方面：確定診斷、輔助診斷和微小殘留病(minimal residual disease，MRD)檢測。
可以明確淋巴瘤診斷：
主要見于具有特征表型并常以白血病形式存在的淋巴瘤類型，如急性淋巴細胞白血病/淋巴母細胞淋巴瘤(ALL/LBL)、慢性淋巴細胞白血病/小淋巴細胞淋巴瘤(CLL/SLL)、毛細胞白血病(HCL)、漿細胞腫瘤(PCN)、T大顆粒淋巴細胞白血病(T-LGLL)、NK細胞-慢性淋巴增殖性疾病(NK-CLPD)、成人T細胞白血病/淋巴瘤(ATLL)等。
作為淋巴瘤輔助診斷：
主要是指免疫表型不具有特異性，或具有特定遺傳學異常的淋巴瘤類型，FCM可以作為形態學、遺傳學的重要補充，起到輔助診斷的作用，常見的有：邊緣區淋巴瘤(MZL)、濾泡淋巴瘤(FL)、幼淋巴細胞白血病(PLL)、套細胞淋巴瘤(MCL)、淋巴漿細胞淋巴瘤/華氏巨球蛋白血癥(LPL/WM)、Burkitt淋巴瘤(BL)、肝脾T細胞淋巴瘤(HSTCL)、蕈樣霉菌病/Sezary綜合征、非特指型外周T細胞淋巴瘤(PTCL，NOS)和血管免疫母細胞T細胞淋巴瘤(AITL)。FCM在大B細胞淋巴瘤中的診斷作用有限，對于有骨髓或淋巴結等組織/器官受累者有一定的參考價值。
MRD監測：
多參數FCM在CLL/SLL的MRD檢測中已得到廣泛地應用和認可，其次是套細胞淋巴瘤和毛細胞白血病，在其他類型淋巴瘤中的應用則少見報道。雖然PCR技術被認為是監測淋巴瘤MRD最敏感的指標，但隨著八色以上FCM的臨床應用，同時以10－4作為cut-off值時，FCM和PCR技術可以相互補充。
FCM檢測流程與方法
樣本處理與準備
FCM樣本主要來源于骨髓、外周血、淋巴結、細針穿刺等細胞學樣本和來源于淋巴結、結外器官或組織的新鮮組織學樣本以及腦脊液、胸腹水等體液標本。所有樣本處理的原則是獲得細胞產量最大化的單細胞懸液，同時保持細胞的活性和完整性，防止目標細胞丟失。骨髓、外周血標本為天然單細胞懸液，抽取標本置于抗凝管中(肝素或EDTA)，室溫保存，盡可能12 h內處理標本。若標本放置時間>12 h，應選擇肝素抗凝。組織學樣本離體后立即置于磷酸鹽緩沖液(PBS)、RPMI 1640培養液等運輸介質或用生理鹽水浸濕的消毒紗布包裹，在送往實驗室的整個過程中需保持其濕度，盡快送檢，長途運輸建議使用RPMI 1640培養液保存。運輸中可加冰袋，但需避免樣本與冰袋直接接觸。樣本應盡量立即處理，將組織沿最大面剖開，肉眼觀察標本是否有結節、溶血或壞死。通常部分標本用于組織學診斷，部分標本做流式細胞學及分子病理檢測。為了防止腫瘤局灶性分布帶來的漏診，可將樣本多點分割，每份厚度2～3 mm，送流式檢測的樣本應緊鄰組織學部分，手動研磨或勻漿機將組織分散成單個核細胞，過濾后進行抗體標記。
檢測前需做細胞存活率評估，通常采用著色DNA的熒光染料(如碘化丙啶和臺盼藍)，可穿過死細胞膜進入內部而染色，需要注意的是，這些染料能和固定后的細胞染色，因此細胞存活率檢測必須采用未做固定的樣本。采集的目的細胞總數應達到5 000個以上，特殊情況也應盡量達到1 500個。
NHL免疫表型特點
FCM診斷NHL涉及B細胞、T細胞和NK細胞的相關系列抗體，這些抗體不僅可用于細胞表型檢測，還可以對細胞克隆性及細胞功能進行鑒別。只有熟練掌握血細胞發育各個階段，以及病理和生理情況下可能出現的表型特征(包括細胞大小、顆粒性、胞膜和胞質抗原的表達)，才能做到精確診斷。
正常成熟的循環B細胞表達CD19、CD20、CD79b、CD22、FMC7和膜表面免疫球蛋白(surface immunoglobulin，sIg)。sIg的輕鏈kappa(sIgκ)和lambda(sIgλ)比值在1∶3和3∶1之間。在B細胞的成熟過程中，末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)、CD34、CD10等不成熟標志逐漸消失，胞質Ig重鏈重排時出現CD79a和PAX5表達，CD20在Ig輕鏈重排時才開始表達，且表達強度逐步增強。正常B細胞成熟過程中抗原的表達增強、減弱或消失多呈漸進性，而腫瘤細胞抗原表達多為均質性增強或減弱。(1)免疫表型特點：大多數成熟B細胞淋巴瘤為表達成熟B細胞標志物(CD19、CD20和CD22等)的單克隆B細胞，某些類型淋巴瘤具有獨特的免疫學特征，結合前向散射光(FSC)和CD5、CD10等抗原的表達特征可以對成熟B細胞淋巴瘤進行進一步區分歸類。對于大部分小B細胞淋巴瘤，FCM結合遺傳學結果可以做出分型診斷，具體可參見中國B細胞慢性淋巴增殖性疾病診斷專家共識(2014年版) ，對于組織樣本活檢考慮為惰性小B細胞腫瘤伴明顯漿細胞分化，并涉及與漿細胞腫瘤鑒別的病例，可行病變部位穿刺及FCM檢查，有助于明確淋巴瘤的具體類型。而大B細胞淋巴瘤由于累及部位所限以及樣本制備中的細胞破壞，則更多依賴免疫組織化學的方法確診。常見的成熟B細胞淋巴瘤免疫表型鑒別診斷見圖1。(2)克隆性檢測：絕大多數成熟B細胞腫瘤限制性表達sIg輕鏈κ或λ(κ∶λ>3∶1或<1∶3)。檢測中如果其他表型正常，但不表達sIg，建議進一步行胞質輕鏈檢測，因后者仍可能出現限制性表達，只有少數成熟B細胞腫瘤可同時有胞膜和胞質的輕鏈表達缺失現象。幾乎所有的漿細胞腫瘤都限制性表達胞質輕鏈，通過透膜方法檢測胞質輕鏈可以確定克隆性，僅有極少數病例胞質、胞膜可同時表達或缺失輕鏈。另外生發中心B細胞可以出現膜表面輕鏈表達下調。
圖1 成熟B細胞淋巴瘤的典型免疫表型鑒別診斷流程圖
T細胞占外周血淋巴細胞的60%～70%，在胸腺中分化發育，成熟過程中CD34、TdT、CD99和CD1a等抗原消失，出現T細胞受體(TCR)基因重排，并最終與膜CD3形成復合物。αβ和γδT細胞在胸腺發育早期出現分化，絕大多數(>95%)循環中的T細胞為TCRαβ型。γδT細胞主要分布在脾臟紅髓、呼吸道和腸道的黏膜和皮下組織內。正常外周血CD4/CD8比值約為2∶1，骨髓中則相反，約為1∶2，正常成熟T細胞表達CD2、CD3、CD5和CD7，表達CD4或CD8，在外周血中CD4、CD8雙陽性和CD4、CD8雙陰性細胞比例極低。(1)免疫表型特點：以下表型時提示有T細胞淋巴瘤的風險：①CD4∶CD8比值失衡，大于10∶1或小于1∶10；②CD4＋CD8＋或CD4－CD8－比例增高；③泛T抗原表達異常，最常見CD7、CD5、CD2或CD3抗原表達強度減弱或增強；④淋巴細胞群中CD16、CD25、CD56、CD57、CD279等抗原表達增多；⑤伴異?？乖磉_(如CD30、CD10、CD20、CD103、CD13和CD33等)。需要注意的是部分樣本中由于腫瘤細胞比例較低而被反應性T細胞掩蓋，此時可結合某些標志物的減弱或增強，通過多參數設門進行分析判斷。由于良性增生的T細胞也會出現某些抗原表達強度改變，因此不能根據單一異常線索直接診斷為淋巴瘤。對于外周T細胞淋巴瘤及淋巴組織增生性疾病的診斷與分型，主要依靠活檢、免疫組織化學染色及TCR基因重排檢測，單純靠FCM表型分析能確診的類型較為有限(圖2)。(2)克隆性檢測：70%的αβT細胞可以通過FCM檢測TCRvβ的24種表位鑒定其克隆性，出現其中1種TCRvβ抗原的顯著增高或者24種表位總和的顯著減低提示T細胞的克隆性增生。由于某些免疫反應中也會出現T細胞的克隆性增生，即使FCM檢測到克隆性T細胞存在，也要結合臨床確定其是否為腫瘤性。如有疑慮，可以通過PCR的方法檢測TCR基因重排來提高檢出的敏感度和特異性。
圖2 常見T/NK細胞淋巴瘤的典型免疫表型鑒別診斷流程圖
正常NK細胞表達CD2和CD7，部分表達CD8，不表達sCD3、CD5、CD4和TCR，NK細胞特征性地表達CD16、CD56、CD94、CD161和顆粒酶B(granzyme B)，或多或少表達CD57和CD8dim，活化的NK細胞在胞質中表達CD3的ε和ζ鏈，FCM檢測結果為sCD3－，cCD3(ε/ζ)＋。外周血中存在兩個NK細胞亞群，絕大多數為CD56dimCD16＋NK細胞，是具有殺傷功能的成熟NK細胞，少數為CD16－CD56strNK細胞，主要分泌細胞因子。(1)免疫表型特點：通常為sCD3－CD5－伴有NK細胞標志物(CD16、CD56和CD57)的表達，部分可出現CD2和CD7表達減弱或缺失，少數病例可獲得CD5的表達。侵襲性NK細胞與EB病毒感染高度相關，白血病表型多為CD3－CD16－CD56str，而NK-CLPD的細胞表型為CD3－CD56dimCD16＋，表型更為成熟；結外鼻型NK/T淋巴細胞淋巴瘤(ENTCL)典型表型為sCD3－cCD3±CD2＋CD56＋，其他NK相關抗原通常為陰性。常見的T/NK細胞淋巴瘤見圖2。(2)克隆性檢測：臨床工作中通常選擇CD158a/h，CD158b、CD158e、CD158k和CD158i等KIR系列抗體用于NK細胞克隆性檢測，但目前市面上的抗體僅能覆蓋部分CD158抗原簇。與T細胞淋巴瘤類似，FCM檢測到NK細胞克隆性并不意味著絕對惡性，需要結合臨床背景包括是否有EB病毒感染等進行綜合分析。
抗體篩選
為了盡可能地優化抗體和樣本用量及對不同亞型淋巴瘤的精確診斷，臨床檢測中通常采用兩步法：先應用一線抗體確定腫瘤屬性和系別，隨后應用二線抗體進行精準分型。在具體抗體選擇方面，可參考國際認可的標準化方案或專家共識(如Euroflow、ICCS)中推薦的熒光染料和克隆號，例如檢測cCD3應選擇克隆號為UCHT1能識別CD3T1鏈的單抗，檢測核TdT(NuTdT)可選擇克隆號為HT-6兔抗人的FITC標記的多克隆抗體。細胞內抗原檢測優先選擇小分子熒光素如FITC。B系一線初篩的抗體包括：CD5、CD10、CD19、CD20、CD45、κ和λ；T/NK系一線初篩抗體包括CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD45和CD56。確定為腫瘤細胞及其系別來源以后，進行第二步全面精細檢測。用于B細胞淋巴瘤精細分型的二線抗體有：CD11c、CD22、CD23、CD25、CD38、CD43、CD79b、CD103、FMC7、bcl-2、cκ、cλ；T/NK細胞淋巴瘤的二線抗體有：cCD3、CD10、CD16、CD25、CD26、CD30、CD57、TCRαβ、TCRγδ、顆粒酶B、穿孔素(perforin)和cTIA-1等。
近年來發現一些新的抗體在淋巴瘤診斷及分型中具有重要價值，已經陸續作為二線抗體應用于臨床，其中B系相關的有CD49d、CD52、CD81、CD123、CD160、CD200；T/NK系相關的有CD279(PD1)、CD94、CD161和CD158(KIR)系列抗原。
較為成熟的FCM-MRD檢測方案主要集中于B細胞淋巴瘤，由于T/NK細胞淋巴瘤病例往往缺乏明確的克隆性依據，FCM對T/NK細胞淋巴瘤的MRD檢測尚不成熟，能用FCM進行MRD檢測的標本主要為骨髓、外周血和腦脊液。(1)慢性淋巴細胞白血病MRD：ERIC(European Research Initiative on CLL)分別于2007年、2013年和2016年推薦了慢性淋巴細胞白血病MRD檢測的四色、六色和八色標準化方案。相對正常B淋巴細胞而言，慢性淋巴細胞白血病細胞除表達CD5外，CD20、CD22、CD79b、CD81表達可見明顯下調或消失，而CD43高表達。根據這些免疫表型特點，利用八色單管方案：CD19/CD20/CD5/CD43/CD79b/CD81/CD22/CD3，獲取白細胞總數達2×106時，檢測靈敏度可達10－5。(2)其他類型淋巴瘤MRD：80%～90%的套細胞淋巴瘤患者初發時可見骨髓或外周血浸潤，這部分患者可以進行FCM-MRD檢測。正常B淋巴細胞表達LAIR-1(CD305)、CD11a、CD62L、CD200，而套細胞淋巴瘤的腫瘤細胞不表達或明顯低表達上述抗原，利用這些免疫表型特征可以很好地檢測套細胞淋巴瘤MRD。(CD3/CD14/CD56)/LAIR-1/CD19/CD5/CD11a/sIgλ/sIgκ/CD45檢測方案靈敏度可達10－4，其中CD3/CD14/CD56用以排除正常T、NK細胞以及單核細胞的干擾；CD3/CD5/CD19/CD20/CD23/CD45/CD62L/CD200檢測方案靈敏度可達2×10－4。典型毛細胞白血病的腫瘤細胞則過表達CD19、CD20、CD22和LAIR-1，同時表達CD11c、CD25、CD103和CD123，利用CD3/CD19/CD20/CD25/CD45/CD103/CD123/LAIR-1抗體組合檢測MRD的靈敏度也可達到10－4，并且與PCR技術有很好的一致性。由于骨髓/外周血浸潤率低，其他類型淋巴瘤的MRD檢測少見報道。理論上只要初發時在骨髓或外周血中能檢出腫瘤細胞，并且具有淋巴瘤相關免疫表型，均可利用FCM技術進行MRD檢測。值得注意的是，CD20等單克隆抗體在治療中的應用，很可能會給FCM-MRD檢測技術帶來假陰性結果，數據分析時應緊密結合臨床。
結果分析與報告
CD45/SSC設門應用最為廣泛，CD19(CD20)/SSC或CD19(CD20)/CD45設門主要針對B細胞白血病/淋巴瘤，但利妥昔單抗治療后不宜采用CD20設門；(m/cCD3)/SSC或(m/cCD3)/CD45設門主要用于T細胞白血病/淋巴瘤。NK/T細胞淋巴瘤容易丟失某一種或者多種標志，加上經常存在正常淋巴細胞干擾，設門較為困難，建議先從T和NK標記中選擇2個以上參數設門，再進行后續抗原檢測。
報告中除患者的個人信息、標本類型、送檢日期、報告者署名及日期等一般資料外，還應詳細描述淋巴瘤細胞的比例、散射光特征、系別、成熟度以及不同抗原的表達特征(增強、減弱、是否缺失以及異常獲得等)，同時可以顯示正常值范圍，避免僅對結果進行簡單的描述，盡可能給出可能的診斷以指導臨床進一步綜合判斷。如果沒有檢測到異常細胞，可直接報告各類細胞所占比例。需要注意的是FCM的陰性結果并不能除外骨髓有淋巴瘤浸潤；如果FCM檢測到單克隆淋巴細胞但缺乏形態學證據，需要在報告中注明，必要時考慮再次行活檢，并建議隨訪。
質量控制
FCM質量控制主要涉及樣本、儀器、試劑、人員等。與NHL診斷相關的需注意以下幾個方面：(1)用于實體瘤FCM檢測的樣本應為具有代表性的活檢樣本的部分，以防止因采樣誤差而導致與形態學結果的不一致；(2)為防止目的細胞丟失，細胞學樣本不推薦使用淋巴細胞分層液分離單個核細胞；(3)組織學樣本如紅細胞較多，需加入少量肝素抗凝劑，但不可用甲醛或其他固定劑固定；(4)樣本處理過程中應采用溶血劑處理紅細胞，氯化銨溶血法適用于骨髓和外周血，而組織學標本盡可能使用甲酸溶血法；(5)檢測B細胞sIg或輕鏈時，染色前需要洗滌2～3遍；(6)在輕鏈檢測時如采用一種單抗檢測結果為陰性時，需更換克隆號復測，或采用多克隆抗體標記以明確為真陰性。
以臨床為基礎的多學科綜合診斷治療是淋巴瘤診治未來發展的方向。本共識綜合闡述了FCM在淋巴瘤診斷及疾病跟蹤監測中的應用，包括方案設計、質量控制以及MRD檢測等內容，希望能對淋巴瘤臨床和病理工作起到補充作用，未來將結合臨床和病理的發展，不斷完善該共識。
參與編寫專家組成員(按單位名稱漢語拼音字母順序排列)：北京大學腫瘤醫院淋巴腫瘤內科(謝彥、朱軍)；復旦大學附屬腫瘤醫院病理科(平波)；華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院血液內科(毛霞、周劍峰)；南京醫科大學第一附屬醫院血液科(李建勇、吳雨潔、徐衛)；上海交通大學附屬瑞金醫院血液學研究所(翁香琴)；四川大學華西醫院病理科(步宏、劉衛平、趙莎)；中國醫學科學院北京協和醫學院北京協和醫院病理科(盧朝輝)；中國醫學科學院血液病醫院病理中心(汝昆、王慧君)，淋巴腫瘤中心(邱錄貴)；中華醫學會中華病理學雜志編輯部(常秀青)；中華醫學會中華血液學雜志編輯部(董文革)